Penulis
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipat gandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro atau suatu teknik biologi molekuler yang digunakan untuk memperbanyak sekuens DNA spesifik.
Prinsip PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.
Terdapat 3 tahapan dalam siklus PCR yaitu denaturasi (penguraian untai ganda DNA), annealing (pelekakatan primer) dan polimerisasi (pemanjangan pasangan DNA komplementer).
Prinsip kerja dari PCR adalah menggandakan segmen DNA tertentu dengan memanfaatkan enzim sebagai penginisiasi replikasi (Roche diagnostics 2006:9).
Hasil dari teknik PCR ialah jumlah untai DNA yang jumlahnya terus bertambah pada tiap siklus sebanyak 2ⁿ, dengan n merupakan nomer siklus.
DNA hasil amplifikasi dengan PCR tidak dapat dilihat secara kasat mata, tetapi dapat diidentifikasi dengan teknik elektroforesis.
Skema
Proses PCR terdiri dari 3 tahap, yakni denaturasi, penempelan (annealing), dan amplifikasi :
1. Denaturasi. Suatu fragmen DNA (double strand) dipanaskan pada suhu 95 ⁰C selama 1-2 menit sehingga akan terpisah menjadi rantai tunggal (single strand).
2. Kemudian dilakukan penempelan (annealing) pada suhu 55 ⁰C selama 1-2 menit, yakni oligonukleotida primer menempel pada DNA cetakan yang komplementer dengan sekuen primer.
3. Amplifikasi. Setelah dilakukan penempelan, suhu dinaikkan menjadi 72 ⁰C selama 1,5 menit.
Pada suhu ini, enzim DNA polimerase akan melakukan proses polimerasi, yakni rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA cetakan.
Proses ini disebut amplifikasi (diperkuat/disalin beberapa kali).
Reaksi-reaksi seperti di atas dapat diulangi sampai 25-30 kali (siklus) sehingga akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru.
Banyaknya amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target yang akan digunakan.
Cara mendeteksi Produk PCR:
Untuk mendeteksi produk dari PCR harus menjadi fragmen atau fragmen DNA panjang yang ditetapkan.
Teknik untuk mendeteksi produk PCR yaitu :
- Gel agarosa dan/atau polyacrylamide elektroforesis gel
- Restriksi endonuklease pencernaan
- Bercak dot
- Kromatografi cair tekanan tinggi
- Electrochemiluminescence
- Pengurutan langsung
Teknik yang paling sederhana dan umum digunakan untuk mendeteksi PRC adalah elektroforesis produk PCR pada gel agarose dengan EtBr (ethidium bromide).
EtBr adalah pewarna fluorescent yang menambah ke dalam DNA.
Ukuran ditandai dapat dielektroforesis pada gel untuk memungkinkan ukuran penentuan produk PCR.
Ukuran ditandai dapat dielektroforesis pada gel untuk memungkinkan ukuran penentuan produk PCR.
Aplikasi PCR
Beberapa contoh penerapan PCR antara lain:
- Studi arkeologi gen purba, seperti fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) yang telah membeku selama 400.000 tahun
- Analisis tindakan kriminal dengan sedikit sampel darah, sperma, sidik jari atau jaringan
- Deteksi virus papilloma pada kelamin manusia
- Deteksi DNA atau RNA virus yang sulit terdeteksi, seperti HIV
- Diagnosa kelainan genetik sebelum kelahiran
- Peramalan hemofilia
- Isolasi DNA dari miselium jamur dan spora
- Pengujian kualitas air minum
- Analisis filogenetik dalam taksonomi
- Identifikasi polimorfisme DNA
- Identifikasi jenis kelamin
- Penentuan urutan nukleotida
- Pemetaan genom manusia
Manfaat PCR :
- Memperkuat gen spesifik sebelum diklon
- Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah
- Dapat mendeteksi/mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan.
- Bidang kedokteran forensik. Contohnya mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi, variasi dan mutasi dari gen.
- Mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana spesies tersebut berasal.
- Melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “finger print"
- Handoyo, D & A. Rudiretna. 2000. General principles and implementation of polymerase chain reaction. http://repository.ubaya.ac.id/35/1/ART002 : 129 halaman. 07 Mei 2014, pukul 12.30 WIB.
- Ahluwalia, K. B. 2009. Genetics. Ed ke-2. New Age International Publisher, New Delhi: ix + 451 halaman.
- Anonim. 2011. “Makalah Genetika PCR”. (Online). http://apikdewefppundip2011.wordpress.com/2012/06/29/makalah-genetika-pcr-polimerase-chain-reaction/. diakses tanggal 13 desember 2013
*Sumber: Poppy D.